REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

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PCR

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) es una técnica que nos permite amplificar in vitro un fragmento específico de DNA, obteniendo un gran número de copias del mismo. Fue inventada por Kary Mullis en 1983, y resultó ser una gran revolución en el campo de la biología molecular.

Reacción en cadena de la polimerasa
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PCR
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MeSH D016133

Sinónimos PCR

La técnica se basa en la capacidad de la enzima DNA-polimerasa para sintetizar una hebra complementaria de DNA usando un molde de cadena sencilla, en dirección 5’-3’, partiendo de una región de doble cadena. En la PCR se parte de dos cebadores o primers que se diseñan específicamente para la región que queremos amplificar. La DNA-polimerasa que se suele utilizar actualmente es la de la bacteria termófila Termus aquaticus (Taq polimerasa), que resiste a altas temperaturas, lo cual permite la desnaturalización del DNA a 95ºC y permite manejar temperaturas de hibridación y extensión que dan margen para conseguir la astringencia deseada para que la reacción amplifique los fragmentos de DNA específicos y así mejore el rendimiento de la reacción. Además, al ser termoestable, permite su activación en sucesivos ciclos sin que se inactive. Cada uno de los dos primers es complementario a los límites de la hebra opuesta de la región de DNA que se quiere amplificar, que previamente ha sido desnaturalizada por calentamiento. Los primers son fragmentos cortos, que pueden ir de 6 a 50 nucleótidos (generalmente son de 18 a 22) de cadena sencilla. Diseñamos las secuencias para que sean complementarias a los dos extremos 3’ de la región a amplificar, una en cada hebra. La longitud del fragmento a amplificar vendrá definida según los primers utilizados. Deben cumplir alguna condición para que la reacción funcione bien, como tener una temperatura de fusión (Tm) igual o muy similar, de manera que puedan hibridar a la secuencia diana a la misma temperatura, y ser de un tamaño similar. Hay otras consideraciones a tener en cuenta, tales como que no sean complementarios entre sí o que no formen estructuras secundarias significativas. Actualmente existen programas informáticos para el diseño de los cebadores. Para la reacción hacen falta también los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) en exceso como sustrato para la síntesis de las copias nuevas de la cadena. La mezcla final para la reacción debe contener iones divalentes, que actúan como cofactores de la polimerasa (normalmente se usa magnesio), iones monovalentes (como el potasio), y una solución tampón que nos mantendrá el pH adecuado para la polimerasa. Una vez mezclados todos los componentes, junto con el DNA molde, del que se quiere obtener la amplificación de un fragmento, se pondrá en un termociclador, un aparato programable que permite someterla a diferentes temperaturas. Por lo general son de 30 a 35 ciclos de 3 temperaturas diferentes cada uno. Los pasos que se siguen son los siguientes:

  • INICIALIZACIÓN, donde la reacción se lleva a una temperatura elevada, normalmente a 94ºC, para activar la DNA-polimerasa (si se requiere). Suele durar entre 4 y 9 minutos. Este paso no forma parte de los ciclos, sino que se realiza solo una vez al principio.
  • DESNATURALIZACIÓN, para separar las dos cadenas complementarias de DNA, que normalmente se hace llevando la reacción a 94-95ºC, durante aproximadamente 30 segundos.
  • HIBRIDACIÓN DEL PRIMER, donde este se unirá a su secuencia complementaria del DNA molde. La temperatura se baja a entre 50 y 65ºC, lo que permite el alineamiento de las dos cadenas (el primer y el molde). Es entonces cuando la polimerasa empieza a sintetizar la nueva cadena de DNA. Este paso suele durar entre 20 y 40 segundos.
  • EXTENSIÓN, en que la enzima DNA-polimerasa sintetiza la nueva cadena de DNA complementario a la secuencia molde, utilizando el sustrato de dNTPs de la mezcla. Lo que ocurre en este paso es que la polimerasa une el grupo 5'-fosfato del dNTP que toque añadir con el grupo 3'-hidroxilo de la cadena sintetizada hasta el momento. De esta forma va creciendo la nueva cadena, en dirección 5'-3'. Las condiciones para este paso utilizando la Taq-polimerasa son 72ºC y un tiempo que oscila según la longitud del amplicón.
  • ELONGACIÓN FINAL, que ya no forma parte de los ciclos y se hace una única vez al final de la reacción. Este paso sirve para que terminen de sintetizarse las copias que hayan podido quedar inacabadas. Para finalizar se lleva la reacción a 4ºC.

El resultado de estos pasos es un crecimiento exponencial en el número de copias del DNA inicial, ya que a cada ciclo (compuesto cada uno por desnaturalización, hibridación del primer y extensión) se duplica la cantidad de producto respecto el ciclo anterior.

Hay algunas consideraciones a tener en cuenta:

  • Es necesario hacer un control negativo, donde en lugar del DNA que se quiera amplificar haya agua, para poder detectar cualquier contaminación de los distintos componentes de la reacción.
  • La Taq-polimerasa debe descongelarse justo antes de su uso, y mantenerla en hielo mientras se utilice.
  • El volumen de DNA a amplificar que pondremos en la reacción dependerá de su concentración.
  • El agua que utilicemos debe ser agua miliQ. Si no es posible, el agua debe ser estéril, des-ionizada y destilada. No debe contener ADNasas.
  • Es recomendable guardar los reactivos a parte, en una caja exclusivamente para ellos, a -20ºC, y hacer alícuotas de volúmenes pequeños para evitar contaminaciones.
  • Se debe utilizar siempre material nuevo y estéril, de uso exclusivo para PCR, y trabajar siempre con guantes y bata.

Para visualizar el resultado de la reacción y comprobar que haya salido correctamente, se hace una electroforesis. La electroforesis es una técnica que nos permite separar las moléculas según su movilidad mediante la aplicación de un campo eléctrico. Para DNA normalmente el soporte utilizado es un gel de agarosa o poliacrilamida. Para el gel de agarosa se añade bromuro de etidio, un agente que se intercala en el DNA y cuando se expone a la luz ultravioleta emite luz rosa. Esto nos permitirá ver nuestra muestra de DNA amplificado en forma de banda. Si esta es gruesa significa que hay mucha cantidad de DNA, y por lo tanto que la reacción ha funcionado. Si es más débil quizás se tenga que cambiar alguna condición para mejorar el rendimiento del proceso. El bromuro de etidio debe ser manipulado con todas las precauciones, ya que resulta altamente mutágeno y puede ser cancerígeno. Actualmente existen alternativas menos peligrosas, como el SYBR Green.

El DNA, al estar cargado negativamente, con la aplicación del campo eléctrico, migra hacia el polo positivo. Así podemos saber el tamaño de la secuencia amplificada, por comparación con un marcador de peso molecular, que generalmente es de 50 o 100 pares de bases por cada banda, y que corre paralelamente a nuestras muestras. A menor tamaño, más migrará, ya que a la molécula le será más fácil moverse a través del gel. La técnica permite también comprobar que no haya contaminación (gracias al blanco). Si aparece banda donde hayamos cargado el blanco significa que la reacción está contaminada, ya que se ha amplificado algún fragmento donde en principio no había DNA molde para ello.

Las aplicaciones de la PCR son muy amplias. En el campo de la investigación se utiliza como base para muchas otras técnicas que requieren tener un pool importante de DNA. La secuenciación del fragmento amplificado es una de ellas, con lo que podemos detectar mutaciones. Otra aplicación importante es la clonación de secuencias de DNA en vectores génicos. En medicina se suele utilizar como técnica diagnóstica, para detectar enfermedades hereditarias, genotipar e identificar agentes infecciosos y diagnóstico prenatal, entre otras aplicaciones. También es utilizada para pruebas de paternidad y análisis forenses.

Enlaces

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*Articulos en Pubmed
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